Лекція №2 для групи 3А ОПП Лікувальна справа

 

Загальні принципи діагностики інфекційних хвороб

Діагностика інфекційних хвороб використовує усі клінічні діагностичні прийоми та способи, які застосовують у внутрішній медицині, однак існують певні особливості. Так у відділеннях інфекційних хвороб при обстеженні хворого додатково до інших видів анамнезу збирають епідеміологічний анамнез — відомості про можливість передавання інфекції від джерела інфекції до захворілого, про ймовірні фактори (шляхи) передавання збудника, про тривалість потенційного інкубаційного періоду. Наявність виявлених чинників епідеміологічного анамнезу дозволяє в підозрюваних випадках окремих інфекційних хвороб (ботулізм, правець, сказ, тощо) виносити діагностичне (часто остаточне) судження про наявність такої інфекційної хвороби відповідно до клініко-епідеміологічних факторів (клініко-епідеміологічної діагностики). Зокрема, у пацієнта з ймовірним випадком ботулізму за наявності типових клінічних ознак (порушення ковтання, зорові ушкодження, міоплегія, закреп, тощо) встановлення факту вживання пацієнтом продукту, в якому міг утворитися ботулотоксин (епідеміологічний чинник), цілком досить для переведення ймовірного випадку в градацію підтвердженого випадку без додаткових лабораторних досліджень.

Методи лабораторної та інструментальної діагностики загалом є спільними з тими, що використовують в інших розділах (галузях) медицини. Але інфекційну хворобу спричинює певний збудник, що дає можливість виявлення його, або його часток (антигенів, ендо- та екзотоксинів, тощо), або імунологічних реакцій у відповідь на його потрапляння до організму (вироблення антитіл, реакції гіперчутливості, тощо). У клініці інфекційних хвороб застосовують наступні методи специфічної діагностики:

·         Для виявлення самого збудника:

·         мікроскопічний (пряма й непряма світлова мікроскопія, електронна мікроскопія; бактеріоскопія, паразитоскопія, в тому числі ово- та гельмінтоскопія, вірусоскопія);

·         бактеріологічний (посіви крові, фекалій, сечі, мокротиння та інших рідин організму на штучні поживні середовища, зараження культури клітин або тканин);

·         вірусологічний (зараження курячих та інших ембріонів, культури клітин або тканин);

·         біологічний (введення в організм лабораторних тварин різних рідин від хворого з метою спричинити в них розвиток інфекційної хвороби, виділити збудника у великій кількості з метою його ідентифікації та вивчення його властивостей);

·        Для виявлення антитіл, антигенів, геномів збудника, його побічних продуктів життєдіяльності:

·         серологічний — виявлення антитіл у реакціях аглютинації (РА), зв'язування комплементу (РЗК), гемаглютинації (РГА), непрямої гемаглютинації (РНГА), гальмування гемаглютинації (РГГА), пасивної гемаглютинації (РПГА), у радіоімунному аналізі (РІА), імуноферментному аналізі (ІФА) тощо);

·         виявлення антигенів, нуклеїнових кислот у реакції імунофлюоресценції (РІФ), ІФА, РІА, полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР), молекулярне клонування, тощо);

·         газова хроматографія;

·         імунохроматографічні тести (експрес-діагностика);

·         реакції гіперчутливості уповільненого типу (внутрішньошкірні проби при туляремії, бруцельозі, тощо);

·         реакція нейтралізації певних токсинів (зокрема, токсину при ботулізмі), яку проводять на лабораторних тваринах.

Безпосереднє виявлення самого збудника

Мікроскопічний метод

·         Світлова мікроскопія рідин, ексудатів і тканин є одночасно найпростішим та одним із найбільш інформативних лабораторних методів, які застосовуються в діагностиці інфекційних хвороб. У деяких випадках це дослідження дозволяє провести точну, високоспецифічну ідентифікацію етіологічного агента. Так при протозойних інфекціях паразитоскопія — взагалі нерідко основний метод підтвердження діагнозу. При малярії, наприклад, до призначення протималярійних препаратів на висоті нападу гарячки беруть на дослідження крові (тонкий мазок і товсту краплю), при амебіазі — досліджують під мікроскопом свіжі фекалії, при лямбліозі — дуоденальний вміст (можна виявити вегетативні форми лімблій) і фекалії (можна знайти цисти). При підозрі на гельмінтози об'єктом дослідження можуть бути фекалії (можна виявити яйця гельмінтів, проглотиди та інші частки тіла гельмінта), дуоденальний вміст (яйця), кров (личинки при міграційній стадії гельмінтозів).

·         При прямій мікроскопії використовують безліч методик. Якщо мікроорганізм має великі розміри або характерну морфологію, з досліджуваного матеріалу можна приготувати незабарвлені нативні препарати та дослідити в світлому полі, в темному полі або за допомогою фазовоконтрастної мікроскопії. Набагато частіше для прямої мікроскопії готують висушені мазки — це дозволяє застосувати різноманітне фарбування, яке полегшує виявлення та ідентифікацію мікроорганізму. Нативні препарати часто використовують для діагностики грибкових і паразитарних інфекцій. Прикладами є криптококовий менінгіт, який діагностують при виявленні інкапсульованого мікроорганізму в препараті цереброспінальної рідини, пофарбованому індійським чорнилом, і кокцидіомікоз, який ідентифікують за наявністю в харкотинні хворого характерних сферул. Дослідження нативних препаратів фекалій або дуоденального вмісту також є початковим етапом у встановленні діагнозу кишкових паразитарних інфекцій, таких як амебіаз і криптоспоридіоз, кишкових гельмінтозів (ово-, мікроскопія тіл або фрагментів самих гельмінтів). На підставі виявлення характерних рухів мікрофілярій і трипаносом у крові та інших рідинах організму можуть бути розпізнані філяріїдози й трипаносомоз.

·         Фарбування за Грамом залишається й після більше ніж століття його застосування найкращим і єдиним широкодоступним методом швидкої діагностики бактеріальних інфекцій з використанням світлового мікроскопа. Його використовують при дослідженні фактично всіх видів клінічних матеріалів, причому найбільшу цінність цей метод має при дослідженні ексудатів, аспіратів і тканинних рідин, включаючи цереброспінальну рідину і сечу. Бактерії виявляються або як темно-сині (грампозитивні), або як рожеві (грамнегативні) тіла. Їхнє забарвлення та морфологічні особливості часто дозволяють проводити попередню ідентифікацію роду, а іноді й виду мікроорганізму. Ряд специфічних мікроорганізмів може бути виявлений при фарбуванні за іншими методиками (за Романовським—Гімзою, за Цілем — Нельсеном^[9], тощо).

·         Електронно-мікроскопічне дослідження використовують переважно для ідентифікації тих вірусів, яким не притаманний цитопатичний ефект у культурі клітин. Це дослідження особливо цінне для виявлення ротавірусів у фекаліях немовлят і дітей раннього віку, які страждають на гастроентерити. Велика кількість і характерні морфологічні риси цих вірусних частинок дозволяють провести їх специфічну ідентифікацію на підставі одних лише цих ознак. Електронна мікроскопія може бути використана також для діагностики хвороб, спричинених вірусами Норфолк (англ. Norwalk).

Бактеріологічний метод[ред. | ред. код]

Незважаючи на певну складність виконання і необхідність іноді досить тривалого часу для одержання результату, виділення етіологічного агента за допомогою культивування на штучних поживних середовищах, як й в культурах тканини або в експериментах на тваринах, є зазвичай найбільш достовірним методом. Однак діагностична цінність досліджуваного методом посіву матеріалу великою мірою залежить від того, чи не був він забруднений (контамінований) при зборі супутньою мікрофлорою, чи був доставлений в лабораторію з дотриманням умов, що гарантують виживання відповідних, іноді дуже вибагливих мікроорганізмів. Чутливість бактеріологічного методу залежить й від обсягу досліджуваного матеріалу. Так для визрівання черевнотифозної сальмонели потрібно брати кров від хворого та рідке поживне середовище (10 % жовчний бульйон) у співвідношенні 1:10. Для виділення того чи іншого збудника можуть бути використані диференційно-діагностичні поживні середовища (телуртове — для виявлення коринебактерій, 1 % лужна пептонна вода — для культивування вібріонів холері, тощо). Іноді для виділення певних збудників потрібні особливі умови культивування. Так для виділення єрсиній необхідним є застосування так званого холодового пророщення — витримування поживного середовища, зараженого цими збудниками при температурі термостата 4°С протягом 2-3 діб. Низька температура пригнічує ріст інших мікроорганізмів, але спричинює бурхливий розвиток єрсиній з утворенням видимих великих колоній. Іноді потрібне тривале очікування через повільне зростання збудників — так бруцели виростають до помітних колоній на яєчному поживному середовищі лише через 1 місяць культивації.

Детальніші відомості з цієї теми ви можете знайти в статті Мікробіологічна культура.

Вірусологічний метод[ред. | ред. код]

Вибір матеріалу для діагностики вірусних захворювань залежить як від стадії самої хвороби, так і від її клінічних проявів. Якщо хворого обстежують на ранніх стадіях захворювання, то часто існує можливість виявити вірус, використовуючи вірусологічний метод. Характер матеріалу, що підлягає вірусологічному дослідженню і метод його транспортування до лабораторії певною мірою залежать від переважного місця ураження. Так при діагностиці більшості вірусних інфекцій дихальних шляхів досить інформативними є мазки зі слизової оболонки глотки. У зв'язку з надзвичайною лабільністю респіраторних вірусів мазки поміщають в буферні транспортні середовища з високим вмістом протеїнів і антибіотиками. Якщо матеріал підлягає транспортуванню до іншої установи, його слід зберігати при температурі −60 °C і перевозити в контейнері із сухим льодом. У хворих на вітряну віспу рідина, отримана з везикул, містить значну кількість вірусу і вірусного антигену. Вірусологічний метод рідко є ефективним для виділення вірусів із крові, за винятком арбовірусних інфекцій.

Детальніші відомості з цієї теми ви можете знайти в статті Вірусна культура.

Біологічний метод[ред. | ред. код]

Іноді не є можливим виділення збудників за допомогою поживних середовищ або клітинних чи тканинних культур. Тоді досить часто проводять зараження різних лабораторних тварин. Зокрема для виділення збудника лепри (вкрай вибагливого при культивуванні збудника) заражають броненосців. Для виділення шигел проводять підкон'юнктивальне зараження ока кролика. При біологічному виділенні збудників можливе зростання їх у різних органах залежно від способу зараження та подальшу його біохімічну, морфологічну та іншу ідентифікацію.

Виявлення антитіл, антигенів, геномів збудника, його побічних продуктів життєдіяльності[ред. | ред. код]

Серологічні дослідження[ред. | ред. код]

Для виявлення специфічного для інфекційної хвороби результату контактування людини з мікроорганізмом, що призводить до імунної відповіді та вироблянню антитіл, застосовують серологічний метод. Зазвичай антитіла у достатній кількості з'являються на 2-му тижні хвороби, але при деяких захворюваннях можуть появитися пізно. Із запізненням з'являються антитіла у старих, ослаблених людей. Але виявлення в сироватці крові хворого антитіл, які реагують з певним антигеном, вказує лише на те, що даний пацієнт мав контакт з антигеном. Тому клінічна інтерпретація серологічних тестів за рідкісним винятком залежить від результатів декількох — серійних визначень. Якщо титр антитіл значно підвищується або, навпаки, знижується, відповідну реакцію можна розцінити як результат свіжого контакту з антигеном. Але оскільки серологічні реакції можуть бути хибнопозитивними через наявність перехресних антитіл до збудників одного роду чи родини, або відображати контакт із цим збудником у минулому (так звані анамнестичні антитіла), то результат вважають достовірним тільки якщо при повторному дослідженні відзначено наростання титру антитіл не менше, ніж у 4 рази. У будь-якого хворого з неясним захворюванням взяту на початку дослідження стерильну пробу сироватки слід зберігати в замороженому стані з тим, щоб за необхідності мати можливість порівняти її з тією сироваткою, отриманою в пізнішому періоді (так звані парні сироватки). Контакт з антигеном може виникати в результаті попередньої вакцинації або невиявленої імунізації через перенесену раніше хворобу у стертій формі, що нерідко ускладнює інтерпретацію титрів сироваткових антитіл. Так звана анамнестична реакція, неспецифічна стимуляція антитіл до інших збудників при тій чи іншій інфекції відбувається тільки у випадку антигенної подібності збудників, може спричиняти певні діагностичні помилки, тому й потрібно проводити дослідження в парних сироватках для виявлення наростання титру антитіл до антигену справжнього збудника. Анамнестична реакція буде характеризуватися або монотонним титром, або його зниженням. Результати серологічних тестів слід інтерпретувати у світлі додаткової інформації про хворого, включаючи такі фактори, як попередня імунізація, перенесені захворювання, можливість впливу хімічних, але етіологічно чужих антигенів, наявність мінливого титру при постановці серійних реакцій на противагу однократному результату. Проти збудника організм виробляє різні групи антитіл (аглютиніни, опсоніни, комплементзв'язуючі, гемаглютиніни тощо), які відповідно виявляють у РА, РЗК, РГА, РПГА, тощо. На жаль, при проведенні цих реакцій можливі хибнопозитивні результати. На сьогодні широко використовують ІФА, який дає можливість розділити антитіла до антигенів збудника за класами — IgM, IgG тощо. Саме наявність IgM чи IgG дозволяє ефективно проводити діагностику — при гострому процесі переважають IgM, що дозволяє відрізнити від результатів вакцинації; при хронічному перебігу інфекційної хвороби, після вдалої вакцинації переважають IgG. Якщо в крові виявлено лише антитіла класу JgM, то у цих випадках дослідження парних сироваток можна не проводити.

Виявлення антигенів і антитіл[ред. | ред. код]

У діагностичному процесі виявлення інфекційних хвороб застосовують низку технічних прийомів, які спрямовані на виявлення мікроорганізмових антигенів, геномів, побічних продуктів збудників:

·         РІФ. При використанні імунофлюоресцентної техніки (РІФ) мазки, які потенційно містять мікроорганізми, фарбують за допомогою препаратів, які включають готові специфічні моноклональні антитіла, мічені флюоресцентними барвниками, і досліджують в люмінесцентному мікроскопі. Пряме флюоресцентне забарвлення мазків-відбитків з епітелію носових ходів може бути використане для швидкої діагностики грипу, ГРВІ.

·         Зустрічний імуноелектрофорез. Найбільш широко застосовуваний метод виявлення антигенів. У цьому варіанті дифузії в Агар-агарагаровому гелі матеріал, досліджуваний на наявність антигену, поміщають в канавку (лунку), зроблену в агарі, а специфічну антисироватку — в іншу (прилеглу) канавку. Потім через агар пропускають електричний струм, в результаті чого відбувається швидке, протягом декількох хвилин зближення антигену та антитіл, їхнє злиття з утворенням преципітату. Реакцію аглютинації часток використовують в тих же цілях, що й зустрічний імуноелектрофорез, але її характеризує більша чутливість, хоча можуть мати місце хибнопозитивні результати, обумовлені термолабільниими компонентами сироватки та ревматоїдним фактором.

·         ІФА. Можна застосовувати окрім виявлення антитіл, ще й для візуального або спектрофотометричного виявлення мікроорганізмових антигенів. ELISA, як варіант ІФА, заснований на тому, що специфічні моноклональні антитіла реагують з міченим ферментом антивидовим кон'югантом. Після обробки відповідним субстратом з'являється зміна забарвлення, яку можна вловити під звичайним світловим мікроскопом.

·         Радіоізотопний аналіз (РІА). Є високочутливим і результати можуть бути отримані протягом декількох годин. При цьому методі тестовий антиген, мічений радіоізотопом, конкурує з антигеном у сироватці хворого за специфічні антитіла в тест-суміші. Вільні та пов'язані антитіла видаляють відмиванням. Потім за допомогою гамма-лічильника аналізують реактивність комплексу антиген — антитіло.

·         ПЛР та молекулярне клонування. Застосування рекомбінантних ДНК-методів ампліфікації уможливило виділення, репродукцію і маркування мікроорганізмів із суворо визначеним унікальним розташуванням нуклеотидів у геномі, що представляють штам, вид, рід або групу.

·         У ПЛР мічені фрагменти ДНК додають до тканинних рідин, ексудату або тканин, які припустимо містять патоген. Із суміші, яку обробили нагріванням або хімікаліями, виділяють ДНК відповідного унікального складу. Після обробки фрагменти ДНК нагрівають повторно. Ця реасоціація або гібридизація високоспецифічна і відбувається тільки між фрагментами, що несуть взаємодоповнювальні одне одного нуклеотиди. Якщо матеріал містить нуклеотид, що послідовно доповнює ті, які знаходяться в пробі, вони будуть гібридизовані та марковані.

·         При молекулярному клонуванні відбувається ізоляція певної послідовності ДНК і отримання багатьох копій цієї послідовності in vivo. Клонування часто використовують для ампліфікації фрагмента ДНК, який містить гени, але може використовуватися й для ампліфікації будь-якої послідовності ДНК, наприклад промоторів, некодуючих послідовностей і випадкових фрагментів ДНК. Перевага рекомбінантних ДНК-методів ампліфікації складається в їхній унікальній специфічності, здатності виявляти єдиний патоген серед безлічі інших й, нарешті, ідентифікувати мікроорганізми, які або складно, або, навіть, неможливо виявити іншими методами.

·         Імунохроматографічні (ІХГ) експрес-тести засновані на швидкому визначенні в пробі певних антигенів. На тест-смужках нанесені розчинні моноклональні антитіла до досліджуваного антигену, що кон'юговані з барвником, який можна легко ідентифікувати навіть у найменших концентраціях. Ці антитіла нанесені поблизу ділянки занурення тест-смужки у фізіологічну рідину (кров, слина тощо). За наявності в субстраті дослідження відповідного антигену з'являється видиме забарвлення. Зазначені тести можуть бути виконані особами, які мають мінімальну технічну кваліфікацію, і вимагають для виконання всього кілька хвилин. На даному етапі розвитку медицини подібні дослідження мають певні недоліки, але їх широко використовують для скринінгового обстеження людей. Для підтвердження результату експрес-тестів у непевних випадках використовують ПЛР та інші тести. На сьогодні такі тести застосовують для діагностики тропічної малярії, ВІЛ-інфекції, вірусних гепатитів тощо.

·         Газовохроматографічний метод полягає в прямому дослідженні клінічних матеріалів за допомогою газорідинної хроматографії з метою виявлення характерних побічних продуктів метаболізму мікроорганізмів. Метод ефективний при диференціації аеробних і анаеробних мікроорганізмів у гною і крові.

Виявлення реакції гіперчутливості уповільненого типу[ред. | ред. код]

Вплив антигенів певних типів різними шляхами і за обставин, не завжди повністю прояснених, призводить до розвитку негайної (анафілактичної, атопічної) або сповільненої гіперчутливості. У певних (далеко не у всіх) осіб активна інфекція деякими (але не всіма) бактеріями і вірусами призводить до розвитку гіперчутливості сповільненого типу. Клінічно наявність цього алергічного стану виявляють за допомогою внутрішньошкірного (в/ш) введення мікроорганізму, на який падає підозра у розвитку алергії, або одного з компонентів цього мікроорганізму. У чутливого індивідуума на місці введення протягом 24—48 годин з'являється набряк певного розміру і еритема. Якщо індивідуум є високочутливим або введена доза антигену надлишкова, може розвинутися виражене місцеве запалення з некрозом, формуванням везикули, надмірного набряку, регіонарною лімфаденопатією, нездужанням і гарячкою. Раніше в такій діагностиці використовували діагностичні алергени:

·         Бактеріальні — туберкулін, лепромін, бруцелін, антраксин, пестин, тулярин, малєїн, дизентерін, орнітин;

·         Протозойні — токсоплазмін, лейшманін, трихомонадний антиген;

·         Гельмінтозні — ехінококовий, трихінельозний, опісторхозний, аскаридозний антигени;

·         Вірусні — антиген кліщового енцефаліту.

Але слід пам'ятати, що достовірність цих реакцій не 100 %, можливі параалергічні реакції, які створюють помилки в діагностиці. Крім того, ці реакції свідчать лише про інфікованість, але не дозволяють судити ані про активність процесу, ані про давність зараження. Іноді спостерігають після проведення такого дослідження зростання проявів хвороби чи загострення хронічного процесу. Тому на сьогодні у клінічній практиці залишили досить обмежену кількість діагностичних алергенів для здійснення діагностики інфекційних хвороб у людей. Антигени, виготовлені в концентраціях, нездатних спровокувати тяжкі реакції, зазвичай використовують для в/ш проб у діагностиці туберкульозу, венеричної лімфогранульоми, м'якого шанкру, бруцельозу, туляремії, сапа, бластомікозу, гістоплазмозу, кокцидіомікозу. Певну кількість діагностичних алергенів застосовують у ветеринарії, зокрема бруцелін (проба Бюрне), малеїн, антраксин, орнітин.

Методи нейтралізації токсинів[ред. | ред. код]

Іноді для виявлення токсинів, як побічних продуктів мікроорганізму, проводять на лабораторних тваринах нейтралізацію токсинів специфічними сироватками. Зокрема при ботулізмі вводять білим мишам сироватку крові від підозрюваного хворого, фільтрат його блювотних мас, промивних вод шлунку. Паралельно мишам вводять специфічну антитоксичну сироватку. Там, де є відповідний сироватці токсин, відбувається його знешкодження і миша залишається живою.